Likit Biyopsi Nedir?
Kanser, bir kişinin hayatı boyunca meydana gelen bir seri somatik gen mutasyonları sonucu oluşur. Somatik mutasyonlar spontan olarak oluşurlar ve herhangi bir hücre tipinden kaynaklanabilir.
Kanser Tanısında Genetik Tarama
Bu değişikliler DNA çoğalması sırasında ortaya çıkan hatalar veya çevre faktörleri ile oluşabilirler. Sonradan oluşan bu somatik mutasyonlar gelecek nesillere aktarılmaz. Bir bireyin tümöründe, somatik değişiklerin saptanması ve anlaşılması kanser tanısı için oldukça kritiktir.
Bununla birlikte kişiye özgü kanser tedavi planı, terapiye cevap izlemi ve kanserin tekrar oluşumun belirlenmesi de çok önemlidir. Bunlara ek olarak tümör geliştikçe ek değişikler elde edebilir. Bu da kemoterapi ya da hedeflenmiş terapiler gibi terapatik ajanların cevabını etkiler.
Doku Biyopsi Yöntemi Nedir?
Tümörde somatik mutasyonların tespiti için kullanılan altın standart yöntem, invaziv bir işlem olan, Doku Biyopsi Yöntemidir. Doku Biyopsi yöntemlerinin uygulanması için İğne aspirasyonu ki en çok kullanılan yöntemdir, Vakum veya Tru-cut olmak üzere 3 farklı yöntem kullanılır.
Bu yöntemlerle elde edilen dokularda yani örneklerde, mikroskobik araştırmalar, Floresans in-situ DNA hibridizasyonu ve immuhohistokimyasal boyama gibi kullanılan metotlar rutin olarak çeşitli kanser tiplerindeki somatik değişiklerin saptanması için kullanılmaktadır.
Klinik laboratuvarlar ve araştırmacılar tarafından kanser gelişimine, metaztasa ve tedavi cevabı ya da direncine sürükleyen binlerce somatik mutasyon listelenmiştir.
Doku Biyopsisi için deneyim oldukça önemli bir faktördür. İlgili dokuya doğru yönden giriş yaparak uygun doku bölgesinden, doğru bir şekilde yeterli miktarda örnek alımı deneyim gerektirir. Kısacası doku biyopsisi ile örnek elde edilmesi zor bir prosedürdür.
Buna ek olarak kanser tedavisi boyunca ve sonrasında genetik kompozisyon içindeki değişiklikler ve rezidüel tümör yükünü belirlemek için yapılan bir seri doku biyopsiler pahalı ve hasta için ağrılı bir süreç olabilir.
Ayrıca tümörün primer bölgesi veya metastaz bölgesi bilinmiyorsa ve cerrahi olarak ulaşılması zor bir yerde ise doku biyopsisi kullanılabilir bir seçenek halinden çıkmaktadır.
Kandan Likit Biyopsi Nedir?
Doku biyopsisi ile yaşanan bu tür olumsuzlukların önüne geçmek adına, kan örneğinden elde edilen tümör DNA’sı ile somatik mutasyonların tespitini sağlayan yeni non-invaziv analiz metotu LİKİT BİYOPSİ 2017 yılı ile birlikte klinik uygulamalara giriş yapmıştır.
Likit biyopsi, moleküler testler için, tümör heterojenliğine yeni bakış açısı, kanserlerin tespiti ve izlemi için değerli bir araç haline gelmektedir. Zengin bilimsel literatürler, Likit biyopsinin, tümör biyobelirteçlerini gerçek zamanlı olarak değerlendirmek, tanısal ve prognostik alanda kanser genotipini ve ayrıca hasta takibi sırasında minimum rezidüel hastalığı ölçmek için geçerli bir araç olduğunu göstermektedir.
Likit biyopsi, standart tümör biyopsilerine önemli ve non-invaziv bir ek olarak, bazı durumlarda da potansiyel bir alternatif yaklaşım olarak hızla gelişmektedir.
Doku biyopsinden farklı olarak bu analiz metotu için gerekli olan örnek sadece 10ml’lik bir kan örneğidir. Elde edilen kandan ayrıştırılan plazmada serbest halde dolaşan hücre dışı DNA (cell free DNA;cfDNA)’nın bir alt komponenti olan sirküle tümör DNA (circulating tumor DNA;ctDNA)’sında değişik kanser türlerinde ki somatik mutasyonların aynı anda saptanması amaçlanmaktadır.
Likit Biyopsi Neden Yapılır?
Likit biyopsinin bir çok kullanım alanı vardır bunlar,
Tedaviye Yanıtın Takibi
ctDNA seviyeleri hastalar arasında büyük farklılıklar gösterse de, zaman içinde bireysel bir hastada ctDNA seviyeleri tümör yükündeki ve tedavi yanıtındaki değişikliklerle iyi bir korelasyon göstermektedir.
Dolaşımdaki cfDNA’nın kısa yarı ömrü (yaklaşık 1 saat), mevcut klinik kullanımdaki (örneğin, karsinoembriyonik antijen [CEA] ve kanser antijeni) birçok standart serum tümör belirleyicisinin tersine, tedaviye yanıt olarak gerçek zamanlı tümör yükünün ölçülmesi için avantajlı olabilir. Birçok standart klinik tümör belirleyicisinin ayrıca sınırlı duyarlılığı ve özgüllüğü vardır.
Buna karşın tümöre özgü klonal değişiklikler (yani, orijinal tümör klonunda mevcut olan ve dolayısıyla tüm tümör hücrelerinde mevcut olan değişiklikler) plazmada yüksek hassasiyetle izlenebilir ve bazı çalışmalarda, hastanın tümöründe ctDNA seviyelerinin, tedavi başlangıcından sonra geçici olarak artabileceğini, çünkü tümör-hücre ölümünün ctDNA’nın daha fazla salınmasına yol açtığını ileri sürmüştür.
Bununla birlikte, tedavinin başlatılmasından sonra 1-2 hafta içinde, ctDNA seviyeleri tedaviye yanıt veren hastalarda dramatik olarak düşer. Gerçekten de, bazı çalışmalar, ctDNA’daki değişikliklerin, tedavi yanıtının tahmininde standart tümör belirteçlerinden daha iyi performans gösterebileceğini öne sürmektedir.
Ayrıca, ctDNA düzeylerindeki bir artış, radyografik ilerlemeden haftalar ya da aylar öncesinden meydana gelebilir. Böylelikle, cfDNA izlemesi için teknolojiler gittikçe daha uygun ve uygun maliyetli hale geldikçe, erken müdahaleyi kanıtlama potansiyeli ya da ilerlemesi klinik yönetim için önemli olabilir.
Direnç ve Tümör Heterojenitesinin İzlenmesi
Hassas kanser tedavilerinin klinik yararı, kazanılan direncin ortaya çıkmasıyla sınırlıdır. Genel olarak, edinilen direnç, seçici tedavi baskısı altında ortaya çıkan, önceden var olan direnç değişikliklerini barındıran bir veya daha fazla tümör alt klonundan kaynaklanır.
cfDNA’nın analizi, tedaviye karşı klinik dirence yol açan moleküler değişikliklerin erken saptanması ve tanımlanması için etkili bir araç haline gelmiştir. cfDNA’nın temel bir avantajı, dirençle ilişkili moleküler heterojeniteyi yakalayabilmesidir.
Kazanılmış direnç genellikle bireysel bir hastada çoklu dirençli alt klonların klonal büyümesi ile karakterizedir. Bu dirençli alt klonlar aynı lezyonda veya farklı metastatik bölgelerde bulunabilir.
Böylece, tek lezyonlu bir tümör biyopsisi, mevcut moleküler heterojenliği önemli ölçüde daha az tahmin edebilir, oysa çoklu direnç mekanizmalarının varlığı, vücut boyunca tümör hücrelerinden salınan cfDNA tarafından yakalanabilir.
EGFR mutasyona uğramış akciğer kanserinde T790M direnç mutasyonunun varlığını tanımlamak için cfDNA kullanımı belirtmiştik. Yapılan diğer çalışmalar, cfDNA analizinin, T790M’nin MET amplifikasyonu gibi başka direnç değişiklikleriyle birlikte varlığını tanımlayabildiğini ve bu tür bir arada var olan değişikliklere sahip hastaların, osimertinib gibi üçüncü jenerasyon EGFR inhibitörleri ile sonraki terapiden daha az fayda sağlayabileceğini göstermiştir.
Benzer şekilde, östrojenreseptör pozitif meme kanseri olan hastaların cfDNA’sındaki bir veya daha fazla ESR1 mutasyonunun saptanması, sonraki hormonal tedavinin daha kötü sonucunu öngörmüştür.
Bu da, standart görüntüleme veya tümör belirteçleri ile ilerlemenin klinik olarak saptanmasından daha önce cfDNA’da çeşitli hedefe yönelik tedavilere direncin gözlemlenebildiğini göstermektedir.
Kanserin Erken Tanısı
Likit biyopsi uygulamalarının en önemli vurgusu, başka türlü sağlıklı, asemptomatik kişilerde basit bir kan testi ile kanserin erken tanısı için potansiyel olmasıdır. Şu anda, bu amaca ulaşmak için hiçbir olgun teknoloji mevcut değildir, fakat böyle bir yaklaşım, cfDNA’nın veya prekanseröz lezyonlar veya erken evre kanserler tarafından salınan diğer materyallerin eser miktarlarını tespit etmek için taramaya maruz kalan büyük ölçüde etkilenmemiş popülasyonda yanlış pozitif sonuçların önüne geçmek adına oldukça hassas bir yöntem ve en aza indirgemek için yüksek özgüllük gerektirecektir.
Örneğin, birçok kanser türünün KRAS, BRAF veya TP53 gibi genlerdeki ortak mutasyonları paylaşması nedeniyle, bir pozitif Likit biyopsi testinden sonra belirli bir organa kanser yerleştirmek zor olabilir. Ayrıca iyi huylu lezyonlar, kanserde görülen aynı mutasyonları taşıyabilir ve cfDNA’yı dolaşımda bırakma potansiyeline sahiptir.
Gerçekten de, iyi huylu nevüsler ilerlemiş kanserlerde gözlenen aynı BRAF mutasyonlarını taşıyabilir. cfDNA’da saptanabilir mutasyonlar ayrıca belirsiz potansiyel klonal hematopoez (CHIP) olarak adlandırılan bir süreç aracılığıyla kemik iliğinde anormal ve sıklıkla iyi huylu klonal popülasyonlardan da kaynaklanabilir.
Kanserin erken tanısı için Likit biyopsinin potansiyelini göstermek amacıyla Chan ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada 20174 Çinli hastada nazofarenks karsinomunu taramak için plazmada EBV DNA’nın saptanması amaçlanmıştır.
Toplam 309 hasta (% 1.5), iki ardışık testte teyit edildiği gibi, plazmada EBV DNA’sı tespit edebildi ve bu hastaların 34’ünde (orijinal popülasyonun %0.17’si), endoskopik değerlendirmede nazofarenks kanseri vardı. Tersine, EBV DNA-negatif hastaların sadece 1’i taramadan bir yıl sonra nazofarenks karsinomu ile başvurdu.
Genel olarak, bu yaklaşımın duyarlılığı ve özgüllüğü sırasıyla %97.1 ve %98.6’dır. Bir diğer çalışma ise Cohen ve arkadaşları tarafından yapılan. Bu çalışmada CancerSEEK olarak adlandırılan, dolaşımdaki protein belirteçleri ile cfDNA’da mutasyon tespitini entegre eden bir tarama yöntemi geliştirildi.
Sekiz yaygın tümör tipi boyunca klinik olarak saptanamayan, metastatik olmayan tümörleri olan 1005 hastanın %70’inde, %69’dan %98’e kadar değişen hassasiyetlerde test pozitifti. Toplam özgüllük ise %99’dan fazlaydı. 812 sağlıklı kontrolün sadece 7’sinde pozitif sonuç elde edildi.
Bu sonuçlar cesaret verici olsa da, asemptomatik hastaların daha temsili bir tarama popülasyonundaki değerlendirmek kritik olacaktır. İleriye dönük klinik çalışmalarda Likit biyopsi taraması yaklaşımlarının ve validasyonunun daha da iyileştirilmesine ihtiyaç duyulmasına rağmen, erken teşhis aracı olarak cfDNA analizi, kanser tıbbı için potansiyel olarak dönüştürücü bir ilerleme sunmaktadır.
Ayrıca, şuanda denetlenen biyoinformatik makine öğrenimini kullanarak, araştırmacılar, vakaların %83’ünde kanserin kendi dokularına lokalize edilmesi için tespit edilen mutasyonların ve proteinlerin profilini kullanmaktadır.
SİRKÜLE TÜMOR DNA (ctDNA) Nedir?
Yaklaşık 70 yıl önce insan kan plazmasında keşfedilen hücre dışı DNA (cfDNA) günümüzde, non-invaziv hastalık biyobelirteçleri olarak çekici bir araştırma konusu haline gelmiştir. Klinik uygulamalara olan ilgi ile birlikte üstel bir artış sağlayarak, geniş bir araştırma alanında popüler ve potansiyel bir hedef halindedir.
cfDNA hem sağlıklı hem de sağlıklı olmayan insanların kan dolaşımda bulunabilir. Tümor ve non-malignant hücreleri de kapsayan bütün hücreler dolaşım sistemine hücreden bağımsız cfDNA salınımı yaparlar.
cfDNA’nın apoptoz veya nekroz yoluyla kan dolaşımına salındığı ve tipik olarak nükleozomla ilişkili DNA’ya karşılık gelen yaklaşık 150-200 baz çifti uzunluğunda çift sarmallı parçalar halinde bulunduğu düşünülmektedir. cfDNA’nın molekülleri, bir saat ya da daha az bir yarı ömür ile dolaşımdan hızla temizlenir.
Normal hücrelerden elde edilen cfDNA, sağlıklı kişilerde düşük seviyelerde (ortalama olarak yaklaşık 10-15 ng plazma seviyesinde ) bulunur ve bu seviye, egzersiz, iltihaplanma, cerrahi veya doku zedelenmesi dahil olmak üzere doku stres koşulları altında artabilir.
Kanserli hastalarda, tümör hücrelerinden salınan cfDNA, genellikle dolaşımdaki tümör DNA’sı (ctDNA) olarak adlandırılır ve genel cfDNA’nın sadece bir bölümünü oluşturur.
Kanserli hastalarda ctDNA’nın genel cfDNA’sındaki fraksiyonu, %0.1’den-%90’a kadar büyük oranda değişebilir. ctDNA’nın fraksiyonu, bireysel bir hastadaki paralel tümör yüküne eğilim gösterse de, aynı kanser türüne sahip hastalar arasında, büyük olasılıkla biyolojik farklılıkları veya ayrı ayrı tümörlerde hücre ölüm oranlarındaki farklılıkları yansıtan önemli değişkenlikler gözlemlenmiştir.
Ayrıca, farklı tümör tipleri olan hastalar, saptanabilir ctDNA sıklığında önemli değişiklikler gösterir. Bu nedenle, ctDNA’nın, saptanması ve analizi için hata bastırma algoritmaları ile algılama sınırları geliştirmiştir.
cfDNA’NIN ANALİZİ VE İZOLASYONU
Tümör kaynaklı cfDNA’nın düşük seviyeleri ve kısa yarı ömrü nedeniyle, cfDNA’nın hem izolasyonu hem de analizi için özel yaklaşımlar gereklidir. cfDNA’nın stabilitesi ve normal kan hücrelerinin parçalanma potansiyeli olup normal DNA ile kontaminasyonu gibi iki önemli durum bulunmaktadır.
Bu durumların önüne geçmek amacıyla cfDNA, standart flebotomi tüplerinde toplanan kandan izole edildiğinden, örnek alımından sonra 1 ile 4 saat içerisinde kandan plazmayı ayırmak için hemen santrifüjlenme işlemi yapılmalıdır. Alternatif olarak fiksatifler içeren özelleşmiş cfDNA toplama tüpleri de bulunmaktadır.
Bu tüpler sayesinde cfDNA oda sıcaklığında 7 ile 14 gün arasında stabil olarak kalabilmektedir. Böylece kolay nakliye, depolama ve toplu veya merkezi işlem yapılabilir.
Kanserli hastalarda normal cfDNA’nın komponenti olan ctDNA’nın fraksiyonu, tipik olarak hastadan hastaya değişkenlik gösterir. Bu nedenle, çok düşük varyant alleli frekanslarında cfDNA’da bulunan mutasyonları, kopya sayısı değişikliklerini veya diğer değişiklikleri saptamak için ultrasensitif yöntemler gereklidir.
Bu yöntemler arasında bulunan dijital PCR (ddPCR) ve Yeni nesil dizileme teknolojileri en sık kullanılan yöntemlerdir. Bu yöntemler sayesinde yüksek duyarlılık ve özgüllükte sonuçlar elde edilmektedir.
Likit Biyopsi Gelecek
cfDNA analizi hızlı bir şekilde onkolojide umut vaat eden birçok klinik uygulama ile bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır.
cfDNA analizinin etkili klinik entegrasyonu, klinik karar verme sürecine rehberlik etmek için sonuçların doğru yorumlanması için bu yaklaşımın avantajları ve sınırlamaları konusunda dikkatli bir anlayış gerekmektedir.
Daha ileriye dönük çalışmalara ihtiyaç duyulmasına rağmen, cfDNA analizi kanser tıbbı üzerinde dönüştürücü bir etkiye sahip olma potansiyelini barındırmaktadır.
Selvi Ergin Ateşer
https://www.instagram.com/liquid.biopsy/
Kaynaklar;
- Cell-Free DNA in the Liquid Biopsy Context: Role and Differences Between ctDNA and CTC Marker in Cancer Management
- Cell-Free DNA: Applications in Different Diseases.
- Application of Cell-free DNA Analysis to Cancer Treatment
- Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cellfree DNA by paired-end sequencing. Clin Chem 2010; 56: 1279-86.
- Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977; 37: 646-50.
- Diehl F, Schmidt K, Choti MA, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 2008; 14: 98590
- Chan KCA, Woo JKS, King A, et al. Analysis of plasma Epstein–Barr virus DNA to screen for nasopharyngeal cancer. N Engl J Med 2017; 377: 513-22.
- Cohen JD, Li L, Wang Y, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 2018; 359: 926-30.
