Kanser tanısında artık genetik testler sıklıkla kullanılmaktadır. Bunların kandan bakılanlarına likit biyopsi denmektedir. “Likit Biyopsi Nedir?” makalemize bakmanızı öneririz.

SİRKÜLE TÜMOR DNA (ctDNA) Nedir?

Yaklaşık 70 yıl önce insan kan plazmasında keşfedilen hücre dışı DNA (cfDNA) günümüzde,  non-invaziv hastalık biyobelirteçleri olarak çekici bir araştırma konusu haline gelmiştir. Klinik uygulamalara olan ilgi ile birlikte üstel bir artış sağlayarak, geniş bir araştırma alanında popüler ve potansiyel bir hedef halindedir.  cfDNA hem sağlıklı hem de sağlıklı olmayan insanların kan dolaşımda bulunabilir. Tümor ve non-malignant hücreleri de kapsayan bütün hücreler dolaşım sistemine hücreden bağımsız cfDNA salınımı yaparlar. cfDNA’nın apoptoz veya nekroz yoluyla kan dolaşımına salındığı ve tipik olarak nükleozomla ilişkili DNA’ya karşılık gelen yaklaşık 150-200 baz çifti uzunluğunda çift sarmallı parçalar halinde bulunduğu düşünülmektedir. cfDNA’nın molekülleri, bir saat ya da daha az bir yarı ömür ile dolaşımdan hızla temizlenir. Normal hücrelerden elde edilen cfDNA, sağlıklı kişilerde düşük seviyelerde (ortalama olarak yaklaşık 10-15 ng plazma seviyesinde ) bulunur ve bu seviye, egzersiz, iltihaplanma, cerrahi veya doku zedelenmesi dahil olmak üzere doku stres koşulları altında artabilir.

Kanserli hastalarda, tümör hücrelerinden salınan cfDNA, genellikle dolaşımdaki tümör DNA’sı (ctDNA) olarak adlandırılır ve genel cfDNA’nın sadece bir bölümünü oluşturur. Kanserli hastalarda ctDNA’nın genel cfDNA’sındaki fraksiyonu, %0.1’den-%90’a kadar büyük oranda değişebilir. ctDNA’nın fraksiyonu, bireysel bir hastadaki paralel tümör yüküne eğilim gösterse de, aynı kanser türüne sahip hastalar arasında, büyük olasılıkla biyolojik farklılıkları veya ayrı ayrı tümörlerde hücre ölüm oranlarındaki farklılıkları yansıtan önemli değişkenlikler gözlemlenmiştir. Ayrıca, farklı tümör tipleri olan hastalar, saptanabilir ctDNA sıklığında önemli değişiklikler gösterir. Bu nedenle, ctDNA’nın,  saptanması ve analizi için hata bastırma algoritmaları ile algılama sınırları geliştirmiştir.

cfDNA’NIN ANALİZİ VE İZOLASYONU

Tümör kaynaklı cfDNA’nın düşük seviyeleri ve kısa yarı ömrü nedeniyle, cfDNA’nın hem izolasyonu hem de analizi için özel yaklaşımlar gereklidir. cfDNA’nın stabilitesi ve normal kan hücrelerinin parçalanma potansiyeli olup normal DNA ile kontaminasyonu gibi iki önemli durum bulunmaktadır.  Bu durumların önüne geçmek  amacıyla cfDNA, standart flebotomi tüplerinde toplanan kandan izole edildiğinden,  örnek alımından sonra 1 ile 4 saat içerisinde kandan plazmayı ayırmak için hemen santrifüjlenme işlemi yapılmalıdır. Alternatif olarak fiksatifler içeren özelleşmiş cfDNA toplama tüpleri de bulunmaktadır. Bu tüpler sayesinde cfDNA oda sıcaklığında 7 ile 14 gün arasında stabil olarak kalabilmektedir. Böylece kolay nakliye, depolama ve toplu veya merkezi işlem yapılabilir.

Kanserli hastalarda normal cfDNA’nın komponenti olan ctDNA’nın fraksiyonu, tipik olarak hastadan hastaya değişkenlik gösterir. Bu nedenle, çok düşük varyant alleli frekanslarında cfDNA’da bulunan mutasyonları, kopya sayısı değişikliklerini veya diğer değişiklikleri saptamak için ultrasensitif yöntemler gereklidir. Bu yöntemler arasında bulunan dijital PCR (ddPCR) ve Yeni nesil dizileme teknolojileri en sık kullanılan  yöntemlerdir. Bu yöntemler sayesinde yüksek duyarlılık ve özgüllükte sonuçlar elde edilmektedir.

Selvi Ergin Ateşer

https://www.instagram.com/liquid.biopsy/

Kaynaklar;

  • Cell-Free DNA in the Liquid Biopsy Context: Role and Differences Between ctDNA and CTC Marker in Cancer Management
  • Cell-Free DNA: Applications in Different Diseases.
  • Application of Cell-free DNA Analysis to Cancer Treatment
  • Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cellfree DNA by paired-end sequencing. Clin Chem 2010; 56: 1279-86.
  • Leon SA, Shapiro B, Sklaroff DM, Yaros MJ. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res 1977; 37: 646-50.
  • Diehl F, Schmidt K, Choti MA, et al. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics. Nat Med 2008; 14: 98590
  • Chan KCA, Woo JKS, King A, et al. Analysis of plasma Epstein–Barr virus DNA to screen for nasopharyngeal cancer. N Engl J Med 2017; 377: 513-22.
  • Cohen JD, Li L, Wang Y, et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science 2018; 359: 926-30.